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Les composants de la PCR

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Les composants de la PCR

pour cuisiner l'ADN

Pour réaliser une PCR, on a besoin de mélanger cinq composants :

1.- Premier composant : la matrice d'ADN, le fragment de séquence que l'on souhaite amplifier en un très grand nombre de copies. Cette matrice peut contenir bien plus que le fragment que l'on souhaite amplifier. Cela n'a pas d'impact car la réaction de PCR n'amplifiera que le fragment ciblé.

2.- Deuxième composant : les amorces d'ADNFragments d'ADN simple brin de quelques dizaines de nucléotides, synthétisés in vitro, et permettant d'initier la synthèse de fragments d'ADN choisis lors d'une PCR. Les amorces fonctionnent par paires. Elles correspondent aux bornes du fragment qu'on cherche à amplifier par PCR, et chacune est complémentaire d'une extrémité du fragment d'intérêt. Ces amorces se commandent aujourd'hui en ligne auprès de compagnies spécialisées, qui les produisent en quelques heures., ces petits fragments d'ADN simple brin que l'on peut faire synthétiser et qui vont permettre d'ancrer la réaction de PCR de telle lettre à telle autre lettre.

3.- Troisième composant : les lettres chimiques qui composent l'ADN (A T G CBases azotées donnant leurs identités aux différents nucléotides. A : adenine, T : thymidine, G : guanine, C : cytosine.). Ces quatre lettres sont aujourd'hui tellement bien connues que l'on peut facilement les faire synthétiser in vitro par des chimistes et les commander directement auprès de fournisseurs spécialisés.

4 & 5.- Derniers éléments, l'enzyme ADN polymérase, ou Taq polymérase (nommée ainsi parce qu'elle provient de la bactérie Thermophilus aquaticus), et son tampon. Les enzymes fonctionnent de manière optimale dans des conditions de salinité et de pH qui sont fixées par une solution tampon.

Tous ces composants, sous forme liquide, sont mélangés ensemble dans des petits tubes et sont manipulés à l'aide de pipettes et de petits embouts en plastique qui permettent de prélever et manipuler des volumes de l'ordre de quelques microlitres (des millionièmes de litre).

Une fois que tous les ingrédients de la PCR sont rassemblés dans un même tube, ce tube (ou ces tubes s'il y en a plusieurs) est placé dans une machine à PCR. Cette machine à PCR est une sorte de four programmable capable d'atteindre différentes températures pendant des durées très précises et prédéterminées. Par exemple, on programme sur la machine les trois étapes de la PCR : la dénaturation à 95°C, l'hybridation à 50-65°C et l'élongation à 72°C. Ce cycle de trois étapes sera répété de manière automatique par la machine environ trente à quarante fois.

Séparer les
fragments d'ADN

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La séparation des fragments d'ADN

Lorsque la PCR est terminée, on sort de la machine un tube contenant un liquide tout aussi transparent qu'au départ. La différence, c'est que si la réaction de PCR a marché (comme on l'espère), il y a maintenant dans le tube un fragment d'ADN amplifié en millions de copies. Et on va à présent visualiser si c'est bien le cas.

Pour cela, on dépose le contenu du tube, et donc le produit de la réaction de PCR, sur un gel d'agarose. L'agarose est dérivé de l'agar-agar, que l'on utilise pour faire du flan. C'est un composé qui se dissout dans l'eau chaude, et qui une fois refroidi, prend une forme gélatineuse légèrement opaque. On coule l'agarose chaud et liquide dans un moule, une petite plaque rectangulaire, en haut duquel on creuse une fente (un puits).

Lorsque le gel d'agarose a refroidi et s'est solidifié, on va déposer dans le puits le contenu du tube qui est sorti de la machine à PCR. Les molécules d'ADN étant chargées, on va pouvoir les séparer en appliquant au gel d'agarose un champ électrique. Les molécules d'ADN sont chargées négativement, et soumises à un champ électrique elles vont donc migrer vers le pôle + du champ, positionné par exemple en bas du gel d'agarose. Après un certain temps de migration, sous l'effet du champ électrique, on ne voit toujours pas l'ADN, mais on sait que ces fragments d'ADN se sont déplacés dans la matrice d'agarose gélifié. On peut alors révéler l'emplacement de l'ADN dans le gel d'agarose en appliquant sur ce gel un agent chimique qui va diffuser dans la matrice d'agarose et s'intercaler dans les molécules d'ADN, agent chimique qu'on peut détecter en exposant le gel aux rayons ultra-violets.

Visualiser l'ADN

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La visualisation des fragments d'ADN

On dépose le gel d'agarose imprégné de cet agent chimique sur un banc de lumière ultraviolette. Cette lumière va permettre de visualiser dans le gel une bande d'ADN colorée et fluorescente qui correspond au produit de la réaction de PCR.

Pour savoir si on a bien amplifié le fragment souhaité, la taille du produit amplifié va être une première indication. On peut connaître de manière théorique la taille approximative du fragment que l'on cherche à amplifier, c'est-à-dire le nombre de paires de bases qui constituent ce fragment. Pour évaluer la taille des fragments de PCR, on fait migrer en parallèle de notre échantillon de PCR un marqueur de taille. Ce marqueur de taille est un mélange de molécules d'ADN différentes, mais dont on connaît la taille de chacun des fragments. Par exemple ce mélange contient un fragment d'ADN de 500 paires de bases, un autre de 1000 paires de bases et une autre encore de 2000 paires de bases et ainsi de suite. Ces fragments vont migrer dans le gel, et la distance de migration étant directement proportionnelle à leurs longueurs, ils vont s'espacer comme les barreaux d'une échelle. On va ainsi pouvoir estimer la taille du fragment d'ADN amplifié par la réaction de PCR en comparant sa position dans le gel d'agarose avec celle des bandes du marqueur de taille (dont les longueurs respectives sont connues).

On va par exemple observer que ce fragment migre à une position située entre les bandes du marqueur de taille de 1000 et 2000 paires de bases, ce qui correspond à la taille du fragment attendu. Pour finir, que l'expérience ait marché ou pas, qu'on ait ou non la bande attendue dans le gel d'agarose, on va prendre une photo de ce gel pour garder une trace de cette expérience dans le cahier de laboratoire. C'est cette photo que nous vous proposons de télécharger.

Isoler les
fragments d'ADN

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Récupération des fragments d'ADN

pour poursuivre l'expérience

La purification du fragment d'ADN qui nous intéresse se poursuit. La première étape consistait à faire migrer ce fragment d'ADN sur un gel pour se débarrasser des autres composants qui étaient aussi dans le tube lors de la PCR (matrice, enzyme, tampon, amorces, etc...).

Pour isoler le fragment d'ADN amplifié, on découpe maintenant sur le banc d'ultraviolets à l'aide d'un scalpel un petit morceau du gel d'agarose qui contient la bande qui nous intéresse, puis on transfère ce morceau d'agarose (environ 1 cm de longueur sur 0,5 cm de largeur) dans un tube à essai propre. Il contient notre fragment complètement isolé du reste.

Il ne reste plus qu'à dissoudre la matrice d'agarose (en la chauffant) dans laquelle le fragment d'ADN est pris, pour récupérer ce fragment purifié. Finalement,, nous cherchons à tester dans des mouches l'activité régulatoire de ce fragment purifié. Il nous faut pour cela l'insérer dans le génome des mouches, ce qui sera possible dans certaines conditions, en l'injectant dans des embryons (voir chapitre 3). Pour l'insérer dans le génome des mouches, il faut préalablement préparer notre fragment d'ADN sous une forme moléculaire particulière. Et pour obtenir cette forme moléculaire particulière, il faut passer par une étape qu'on appelle le clonage moléculaireIsolation d'un fragment d'ADN au sein d'une molécule d'ADN appelée plasmide. Le plasmide et son insert cloné sont maintenus dans des bactéries utilisées comme usines pour la production et l'amplification de cette molécule..

Le clonagemoléculaire

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Le clonage moléculaire

Le clonage moléculaire permet de recombiner entre eux différents fragments d'ADN. Cette manipulation d'ADN fait appel, une fois encore à des enzymes, mais également à des bactéries, qui permettent d'une part de conserver l'ADN recombiné, mais également de produire cet ADN recombiné en grande quantité. Les bactéries servent donc en quelque sorte d'usine à ADN.

Dans un premier temps, nous allons insérer (on dit aussi « recombiner ») le fragment d'ADN amplifié par PCR dans une molécule d'ADN d'origine bactérienne appelée plasmidePetite molécule d'ADN circulaire, capable de se maintenir dans une bactérie (en plus du matériel génétique propre à la bactérie). Un plasmide est notamment capable de se répliquer de manière autonome, ce qui lui permet de ne pas être dilué au fil des divisions de la bactérie. Certains plasmides sont utilisés en biologie moléculaire, dont il sont des outils essentiels.. Ces plasmides sont de petites molécules d'ADN circulaires qui sont capables de se maintenir de manière autonome dans les bactéries.

Pour associer notre fragment d'ADN à un plasmide, on coupe un plasmide (pour le linéariser) avec des protéines particulières, des protéines-ciseaux. On peut alors relier entre eux le fragment d'ADN purifié et le plasmide linéarisé par l'enzyme-ciseaux. Cette ligation s'effectue grâce à d'autres enzymes, des enzymes-colle ! En reliant ces deux molécules linéaires ensemble, on obtient une nouvelle molécule circulaire : le plasmide de départ, contenant en son milieu le fragment d'ADN amplifié par PCR. Cette première étape du clonage moléculaire est réalisée in vitro.

La deuxième étape du clonage moléculaire consiste à introduire cette nouvelle molécule circulaire dans des bactéries. Il s'agit de l'espèce Escherichia coliBactérie commensale de la flore intestinale humaine. Cette bactérie est utilisée par les généticiens et les microbiologistes pour le clonage moléculaire, comme usine à ADN., une bactérie qui fait partie de notre flore intestinale (la souche utilisée est très dérivée comparée aux bactéries qui peuplent notre intestin, mais c'est bien la même espèce). Il existe plusieurs méthodes pour introduire un plasmide dans des bactéries. On peut par exemple faire subir à ces bactéries un électrochoc, ce qui va fissurer de manière transitoire leurs membranes cellulaires. Si les bactéries baignent alors dans une solution qui contient le plasmide, celui-ci va pénétrer dans les bactéries à travers les fissures des membranes. Après avoir pénétré dans les bactéries, les plasmides recombinés vont se maintenir. Au fur et à mesure que les bactéries se divisent elles vont transmettre le plasmide de génération en génération. Les bactéries permettent un stockage permanent du plasmide, car à tout moment, nous pourrons récupérer et purifier le plasmide.

Suite à l'électrochoc, cependant, toutes les bactéries ne vont pas incorporer le plasmide, certaines vont le faire et d'autres pas. Comment peut-on alors faire le tri ? On utilise pour cela une astuce génétique qui repose sur l'existence de gènes de résistance à des antibiotiques. Les bactéries meurent en présence d'antibiotiqueMolécule capable d'arrêter la croissance des bactéries, voire de tuer les bactéries. Certaines bactéries possèdent des gènes capables de neutraliser l'effet d'un antibiotique et appelés gènes de résistance aux antibiotiques., sauf si elles possèdent un gène de résistance contre cet antibiotique ! Ce gène de résistance est porté par le plasmide qu'on utilise pour réaliser le clonage moléculaire. Ainsi, toutes les bactéries qui auront intégré le plasmide seront protégées contre l'antibiotique et survivront, alors que les bactéries qui n'auront pas intégré le plasmide seront éliminées par l'antibiotique. Pour identifier et isoler les bactéries qui ont incorporé le plasmide, on fait pousser les bactéries, juste après le choc électrique, dans un milieu contenant l'antibiotique. On verse quelques centaines de microlitres de la culture de bactéries sur la surface d'une boîte de Petri (nommée ainsi après le microbiologiste qui les a inventées) qui contiennent du milieu de culture pour bactéries dans de l'agarose (encore !) ainsi que l'antibiotique. Après quelques heures de culture sur ces boîtes, et donc de sélection par l'antibiotique, on voit apparaître un certain nombre de petites tâches blanches à la surface, ce sont des clonesDans ce contexte, il s'agit de clones bactériens. Chaque clone est une colonie de bactéries identiques entre elles, contenant chacune un plasmide dans lequel est inséré un fragment d'ADN d'intérêt. bactériens, des colonies de bactéries qui chacune portent le plasmide qui nous intéresse, puisque ce sont les seules capables de survivre en présence de l'antibiotique.

Purification de l'ADN

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Récupération des fragments d'ADN

L'intérêt de faire produire de l'ADN aux bactéries, c'est qu'elles vont produire de très grandes quantités de plasmide, très rapidement (en quelques heures de culture) et à moindre coût. Et on peut à tout moment et très facilement extraire l'ADN des bactéries. Pour cela, il suffit de faire éclater les cellules d'une culture bactérienne puis de séparer le chromosome bactérien, qui est relativement gros, de l'ADN du plasmide qui lui est beaucoup plus petit. On peut ainsi aisément récupérer spécifiquement l'ADN du plasmide en solution, qu'on voit ici sous cette forme un peu nuageuse. Ce précipité un peu laiteux, c'est l'ADN du plasmide prêt à être injecté.