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Révéler l'invisible

L'objectif du projet de recherche présenté dans ce livre est d'identifier les changements génétiques responsables de l'apparition au cours de l'évolution d'une tache de pigmentation au bout des ailes chez certaines espèces de drosophiles.

On a vu au premier chapitre qu'on testait en fait une hypothèse particulière. L'hypothèse qu'il existerait autour du gène yellow, un gène important pour fabriquer des pigments noirs chez les mouches, un interrupteur génétique qui « allumerait » ce gène au bout de l'aile des mouches qui ont une tache. Cet interrupteur génétique du gène yellow serait apparu spécifiquement chez les espèces aux ailes tachetées. Et pour tester cette hypothèse nous avons tenté d'isoler et de caractériser cet hypothétique interrupteur génétique.

Les chapitres 2 et 3 ont présenté les différentes étapes expérimentales de ce travail, en décrivant comment sont amplifiés et isolés de petits fragments de séquences non-codantes entourant le gène yellow, et comment ces fragments sont combinés au gène de la GFP (notre ampoule moléculaire), et enfin comment chacune des constructions-rapporteurs obtenue est insérée dans le génome des mouches pour obtenir des lignées transgéniques, chacune contenant un fragment d'ADN non-codant du gène yellow, couplé au gène de la GFP.

On arrive maintenant à la phase finale dans laquelle on va analyser la distribution de la GFP dans chacune de ces lignées transgéniques, et ainsi révéler l'activité d'interrupteurs génétiques des séquences d'ADN non-codant entourant le gène yellow.

Métamorphose

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Métamorphose

On peut révéler la distribution de la GFP – en détectant la fluorescente émise spontanément par cette protéine – dans les différents tissus de la mouche et à toutes les étapes de son développement et de son cycle de vie. On s'attend en particulier à trouver des interrupteurs du gène yellow actifs pendant la métamorphose, puisque c'est la phase durant laquelle les caractères adultes (et en particulier la pigmentation) se mettent en place et durant laquelle le gène yellow est exprimé.

Pour mémoire, le développement des mouches (et de nombreuses espèces d'insectes) consiste en trois phases bien distinctes. Tout d'abord l'embryogenèse, au cours de laquelle l'embryon se transforme en larve. La vie larvaire constitue la deuxième étape, durant laquelle l'animal croît très rapidement (la masse augmente d'un facteur 200 en 5 jours !). Enfin, la larve se métamorphose en adulte. Chez les mouches, la métamorphoseProcessus de transformation (en particulier chez les insectes) de la larve en adulte. s'appelle la pupaison et dure 4 jours (pendant cette étape, la mouche, qui ne s'alimente plus et vit sur ses réserves accumulées pendant la vie larvaire, s'appelle la pupe). La vidéo montre en accéléré ce qui se produit pendant ces 4 jours et comment la larve se transforme progressivement en adulte, dont on voit peu à peu apparaître les caractères distinctifs, en particulier la coloration des yeux, puis la pigmentation de tout le corps.

On va s'intéresser aux différentes parties du corps de la pupe, et bien sûr en particulier les ailes dans lesquelles on s'attendrait à trouver des interrupteurs actifs du gène yellow. Et pour accéder à ces différentes parties du corps, on va disséquer les pupes pour en dégager les ailes, les pattes et le reste du corps pour pouvoir les observer ensuite au microscope.

Préparationdes échantillons

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Préparation des échantillons

Afin d'analyser les lignées transgéniques pour visualiser l'expression de la GFP, on isole différentes parties de la pupe – par exemple une patte, une aile, une antenne – qu'on va déposer entre deux fines lames de verre conçues pour l'observation microscopique.

Chaque échantillon, chaque tissu est déposé sur une lame de microscope dans une goutte de liquide – ça peut être tout simplement de l'eau – et recouvert d'une lamelle couvre-objet très fine. La préparation ainsi obtenue pourra ensuite être observée au microscope.

Au delàdu visible

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Au delà du visible

Un microscope permet essentiellement d'observer de petits objets à fort grossissement, comme une loupe mais pour des échantillons encore plus petits. Avec un microscope classique (on parle de microscopie optique) on peut observer des échantillons en lumière visible, c'est-à-dire comme on les verrait à l'œil nu, mais à fort grossissement. Grâce à la microscopie à fluorescence on peut aussi visualiser dans des tissus biologiques des molécules qui émettent de la lumière uniquement à certaines longueurs d'ondeGrandeur qui caractérise une lumière donnée. La lumière est une onde, c'est-à-dire une phénomène périodique, et sa longueur d'onde est la taille d'une période. Du point de vue de ce que l'on perçoit, des lumières de longueurs d'onde différentes vont avoir des couleurs différentes (lumière bleue, lumière ultra-violette), pas toujours visible d'ailleurs (infra-rouge). et qui ne sont pas visibles à la lumière blanche, comme c'est le cas par exemple pour la GFP.

Si on observe, éclairées par de la lumière blanche, des mouches qui expriment de la GFP, on ne va pas voir la GFP, même à très fort grossissement. En revanche, si on éclaire les échantillons avec une certaine longueur d'onde (correspondant à l'ultra violet ou au bleu intense), cela va exciter spécifiquement les molécules de GFP qui vont en retour émettre une lumière à une autre longueur d'onde particulière (en l'occurrence celle correspondant à la couleur verte). On peut détecter cette longueur d'onde particulière au moyen d'un jeu de filtres optiques placés devant les lentilles du microscope et ainsi visualiser la fluorescence émise par la GFP dans un échantillon.

Un microscope à fluorescence est donc une sorte de grosse loupe très sophistiquée, équipée d'une platine qui porte la lame sur laquelle sont déposés les échantillons, d'un objectif (la loupe elle-même), des filtres pour sélectionner les longueurs d'onde qui passent à travers l'objectif, et des sources de lumière (des lasers qui émettent de la lumière à des longueurs d'onde particulière). La lumière émise par les échantillons en réponse à l'excitation fournie peut être observée à travers des oculaires, ou bien elle peut être renvoyée vers une caméra numérique montée sur le microscope et reliée à un ordinateur pour faire des photos.

L'activité des séquences régulatrices révélée

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L'activité des séquences régulatrices révélée

Pour chacune des lignées transgéniques produites, nous avons analysé les différentes parties du corps de la pupe pour rechercher l'expression de la GFP. Parmi les lignées testées, nous en avons trouvé certaines présentant de l'expression de la GFP dans la patte. Cela indique l'existence d'un interrupteur capable d'allumer le gène yellow dans la patte, dans le fragment d'ADN contenu dans la construction-rapporteur.

Nous avons également trouvé d'autres fragments d'ADN contenant des interrupteurs capables d'allumer la GFP dans l'abdomen, dans le thorax, dans les antennes... bref, dans différentes parties du corps de la mouche.

Sous les pigments,la GFP

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Sous les pigments, la GFP

L'analyse de ces différentes lignées transgéniques nous a permis de mettre en évidence plusieurs interrupteurs génétiques, chaque interrupteur contrôlant un aspect de l'expression du gène yellow (dans la patte, dans l'antenne, dans l'abdomen...).

Dans le cas de notre projet, nous cherchions à savoir si un nouvel interrupteur génétique du gène yellow était apparu au cours de l'évolution des espèces aux ailes tachetées, interrupteur responsable de l'expression du gène yellow au bout des ailes. Pour explorer cette possibilité nous avons donc examiné la présence et la distribution de la GFP dans les ailes de chacune des lignées transgéniques.

Pour la grande majorité des lignées, nous n'avons pas détecté d'expression de la GFP dans l'aile. Mais un beau jour, après des mois de recherches infructueuses, nous avons eu l'agréable surprise d'identifier une lignée transgénique dans laquelle la GFP est exprimée dans les ailes. Qui plus est, la distribution de la GFP dans les ailes ressemble étrangement à la distribution de la pigmentation sur les ailes des mouches adultes.

Que signifie ce résultat ? Ce résultat valide notre hypothèse : il existe bien un interrupteur génétique autour du gène yellow qui contrôle son expression en forme de tache qui préfigure la pigmentation adulte. En effet, au moment où nous regardons l'expression de la GFP dans l'aile, c'est à dire pendant la métamorphose des mouches, les ailes ne sont pas encore pigmentées. L'interrupteur dont nous visualisons l'activité grâce à la GFP dicte l'expression du gène yellow et préfigure donc l'emplacement où la pigmentation va apparaitre (la pigmentation apparait progressivement après l'éclosion de la mouche adulte).

Il est remarquable d'observer la correspondance quasiment parfaite entre l'expression de la GFP (et donc l'activité de l'interrupteur génétique auquel elle est couplée) et la forme de la tache de pigmentation qui apparaîtra un peu plus tard dans la vie de la mouche. La forme de la tache sur l'aile est précisément déterminée par l'activité de l'interrupteur génétique du gène yellow, à la cellule près !

Des interrupteurs modulaires

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Des interrupteurs modulaires

Cette expérience, en trois temps, a permis de cartographier les régions régulatrices (contenues dans les séquences d'ADN non-codant) qui entourent le gène yellow. En particulier, cette expérience a mis au jour l'existence d'une multitude d'interrupteurs génétiques, chacun fonctionnant de manière autonome pour allumer l'expression du gène yellow dans différentes parties du corps (dans les pattes, dans l'abdomen, dans le thorax, dans les antennes, etc…). De plus, elle a mis en évidence l'existence d'un nouvel interrupteur génétique responsable de l'activation du gène yellow spécifiquement au bout des ailes chez les espèces aux ailes tachetées.

Nouvel interrupteur nouvelle tache

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Nouvel interrupteur – nouvelle tache

Nous avons appris grâce aux constructions-rapporteurs comment l'expression du gène yellow dans les différentes parties du corps de la mouche était contrôlée par différents interrupteurs génétiques. On peut à présent revenir à la question initiale de ce projet qui était de savoir comment une tache de pigmentation est apparue au cours de l'évolution chez certaines espèces de drosophiles alors que les autres ont des ailes entièrement transparentes.

Si on compare le gène yellow entre des espèces qui ont une tache au bout de l'aile et des espèces qui n'en n'ont pas, la première chose qui frappe c'est la similarité de ce gène entre ces différentes espèces. D'une part ce gène est bien présent chez toutes les espèces de drosophiles et d'autre part sa séquence codante est très largement conservée voire quasiment identique chez toutes les espèces de mouches, donc la protéine (le pinceau noir) fonctionne de la même manière.

Concernant la régulation du gène yellow on retrouve chez différentes espèces la plupart des interrupteurs génétiques actifs dans différentes parties du corps de la mouche. Par exemple, on trouve un interrupteur qui est responsable de l'expression du gène au bout de l'abdomen et qui permet à ce gène pinceau de produire de la pigmentation noire sur l'abdomen des mouches. De manière plus générale, l'ensemble des interrupteurs génétiques qui activent l'expression du gène yellow dans les différentes parties du corps, sont présents chez toutes les espèces, avec ou sans tache sur l'aile.

Une différence majeure entre les espèces qui ont une tache au bout des ailes et les espèces qui n'en ont pas, c'est l'apparition au cours de l'évolution des espèces aux ailes tachetées d'un nouvel interrupteur génétique. Ce nouvel interrupteur active l'expression du gène yellow, et donc la production du pinceau noir, au bout des ailes pendant la métamorphose, ce qui permet donc de peindre une tache noire sur les ailes. Ce nouvel interrupteur génétique est apparu au cours de l'évolution par l'accumulation progressive de mutations, des changements dans la séquence d'ADN, dans une région non-codante du gène yellow, mutations qui ont modifié la séquence et donc la fonction de ce fragment d'ADN non-codant.

Une animation vidéo accessible via le menu bonus sur la page de démarrage, précise le fonctionnement des interrupteurs génétiques.

Des formesà n'en plus finir

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Des formes à n'en plus finir

On a étudié à travers cet exemple l'évolution d'une forme morphologique entre deux espèces de mouches et on a vu que l'évolution de cette forme, de cette tache au bout des ailes, était liée à des changements dans la régulation d'un gène via l'apparition d'un nouvel interrupteur génétique. Chez les animaux – et chez les plantes d'ailleurs aussi – la diversité des formes va bien au-delà de changements de pigmentation. On peut donc se demander dans quelle mesure les changements de forme sont liés, de manière plus générale, à des changements de régulation des gènes.

Depuis une dizaine d'années, les exemples se sont accumulés (par l'étude par de nombreux laboratoires qui étudient des caractères morphologiques très différents) soulignant le rôle majeur des changements régulatoiresModification de l’expression d’un gène résultant (dans le contexte qui nous intéresse ici) d’une modification de la séquence d’un élément régulateur d’un gène. pour expliquer les changements de forme des animaux et des plantes. La conclusion générale qui se dessine c'est que les changements régulatoires, donc les mutations qui modifient la régulation de l'expression des gènes au cours du développement embryonnaire, constituent un moteur essentiel de la diversification des formes au sein du vivant.

Au-delà des formes, les espèces vivantes, et en particulier les plantes et les animaux, se distinguent les unes des autres de différentes manières, en particulier par leurs physiologies, et dans le cas des animaux par leurs comportements. On peut alors se demander si ces principes d'évolution régulatoire qui opèrent sur la morphologie concernent aussi l'évolution des autres caractères.

Les exemples sont moins nombreux que pour l'évolution des formes, mais l'image qui émerge c'est que des changements de régulation de l'expression des gènes participent également aux changements de physiologie, des adaptations physiologiesEnsembles des activités cellulaires qui traduisent l’état vivant d’une cellule, d’un tissu ou d’un organisme. La physiologie inclut le métabolisme, la respiration, la digestion, les flux hormonaux... à différents environnements, et également, dans un certain nombre de cas, à l'évolution du comportementsUn comportement est un ensemble cohérent de mouvements coordonnés réalisé par un animal. Les comportements sont généralement dirigés vers un but, telles la reproduction ou l’alimentation. des animaux.

Les modifications des séquences régulatrices, et en particulier des interrupteurs génétiques localisés dans les séquences non-codantes des gènes, jouent donc un rôle essentiel dans la diversification du vivant. Le rôle fonctionnel des séquences régulatrices (les interrupteurs), qui a longtemps été sous-estimé, est aujourd'hui revisité aussi bien dans le contexte de l'évolution des êtres vivants, que dans le cadre des multiples pathologies génétiques rencontrées dans les populations humaines. Mieux comprendre le fonctionnement des séquences régulatrices est un enjeu essentiel de la recherche biomédicale.

Une tachequi fait mouche ?

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Une tache qui fait mouche ?

Ce projet, tel que nous l'avons présenté, s'est focalisé exclusivement sur la nature des mécanismes génétiques responsables de l'apparition de la tache de pigmentation sur des ailes de mouches. Jusqu'à maintenant, nous avons soigneusement laissé de côté la fonction éventuelle de cette tache.

La tache de pigmentation au bout des ailes n'est présente que chez les mâles des espèces aux ailes tachetées, les femelles de ces espèces ont les ailes totalement transparentes. Cette différence entre mâle et femelle laissait penser que la tache pouvait jouer un rôle pendant la parade sexuelle. Chez la plupart des espèces animales, les mâles usent de toutes sortes d'astuces pour attirer l'attention de leur belle et tenter de la séduire. Très souvent ce sont des ornements colorés, mis en avant par les mâles devant les femelles courtisées. La roue que le mâle paon présente devant les femelles en déployant les plumes de sa queue en est l'exemple le plus connu. Chez les mouches aux ailes tachetées, les mâles déploient leurs ailes devant la femelle qu'ils courtisent et se livrent à une petite danse caractéristique de ces espèces. Les mouches femelles sont-elles sensibles à ces signaux et à ces charmes? On ne le sait pas encore.

La présence simultanée chez les mâles de nombreuses espèces de caractères morphologiques et de comportements de parade sexuelle très élaborés est un thème récurrent dans l'évolution des animaux. Ceci suggère, comme l'a proposé Darwin, que ces caractères (morphologiques et comportementaux) ont évolué de manière concerté chez les mâles et contribuent au succès reproducteur des individus qui portent ces caractères.

On voit donc que pour comprendre de la manière la plus complète possible l'évolution des caractères et des espèces qui les portent, il faut non seulement s'intéresser aux mécanismes génétiques responsables de l'apparition des caractères, comme nous l'avons fait pour la tache sur les ailes, mais également aux mécanismes fonctionnels et aux forces sélectives qui agissent sur ces caractères.