Téléchargement en cours

La transgenèse

Signet
Position sauvegardée

La transgénèse

Nous avons vu dans le premier chapitre que l'origine de la diversité morphologique des animaux était à rechercher dans les changements de la régulation de l'expression des gènes. Ces changements d'expression des gènes résultent de modifications de séquences d'ADN particulières, les interrupteurs génétiques, qui contrôlent où et quand les produits des gènes sont synthétisés.

Dans le chapitre précédent, nous avons vu comment on isole et manipule les séquences d'ADN qui contiennent potentiellement ces fameux interrupteurs génétiques, et comment on les recombine avec le gène de la GFP pour produire des constructions-rapporteurs.

Nous arrivons à l'étape suivante qui consiste à introduire ces constructions-rapporteurs dans le génome des mouches. Une fois intégrées au génome, ces constructions nous permettront de visualiser, directement dans les mouches, la distribution de la GFP, et donc de détecter l'activité d'interrupteurs génétiques de chacun des fragments d'ADN insérés dans les différentes constructions réalisées.

Ce chapitre va examiner comment on produit des mouches transgéniques, c'est-à-dire des mouches dont on a modifié le génome. Ici, la modification apportée au génome consiste en l'ajout de ces constructions-rapporteurs. D'une manière générale, les changements apportés à des organismes génétiquement modifiés peuvent être des modifications de séquences, des ajouts ou des délétions.

Ces modifications du génome s'apparentent à ce que l'on pourrait faire à un livre, dont on pourrait enlever une phrase ou une page, ou bien au contraire en rajouter, ou bien encore en modifier le contenu.

Les élémentsmobiles du génome

Signet
Position sauvegardée

Les éléments mobiles du génome

La plupart des techniques de transgénèse, qui permettent la production d'organismes génétiquement modifiés, exploitent les propriétés d'un type de séquences particulières que l'on retrouve dans tous les domaines du vivant : les éléments transposablesPetites molécules d'ADN insérées dans le génome d'une espèce et capable de s'y déplacer (souvent en se dupliquant) de manière autonome. Certains de ces éléments ont été détournés et sont devenus des vecteurs pour la transgénèse., ou éléments mobiles. Ces petites séquences d'ADN ont la particularité de pouvoir se déplacer de manière autonome dans le génome. Ce sont en quelque sorte des parasites moléculaires constitués d'ADN qui peuvent sauter d'un endroit du génome à un autre, comme des mots ou des phrases qui sauteraient spontanément dans un texte d'une position à une autre.

« Les éléments transposables sont utilisés par les généticiens comme de véritables chevaux de Troie pour modifier les génomes. »

Ces éléments mobiles ont été découverts dans les années 1940 par une généticienne américaine, Barbara McClintockGénéticienne américaine qui a découvert, au cours des années 1940-1950, les éléments transposables - des éléments mobiles du génome- en étudiant la génétique du mais. La portée de ces travaux ne sera reconnue que tardivement, puisque B. McClintock recevra le Prix Nobel de physiologie ou médecine en 1983 pour cette découverte majeure., qui étudiait la génétique du maïs. Ce sont par exemple ces éléments mobiles, et leur intégration dans différents gènes impliqués dans la coloration des grains, qui sont responsables des variations de couleurs des différents grains de maïs d'un même épi.

Cette découverte a valu à McClintock le prix Nobel de médecine et physiologie en 1983. Aujourd'hui les propriétés de ces éléments mobiles permettent de modifier les génomes. Les généticiens les utilisent comme des petites navettes moléculaires pour introduire dans les génomes les modifications de séquence qu'ils souhaitent, par exemple pour insérer une construction-rapporteur.

Ces éléments mobiles transposables ne se retrouvent pas seulement chez le maïs, ils sont présents dans le génome de quasiment tous les organismes vivants. Par exemple le génome humain en contient différentes variétés en très grand nombre. A tel point que les séquences d'éléments mobiles, qui peuvent également se dupliquer avant de se re-insérer et donc augmenter en nombre, constituent environ 50% de la séquence de notre génome.

Intégrationdans le génome

pieds
Signet
Position sauvegardée

Les pieds

Afin que les constructions-rapporteurs puissent intégrer le génome d’une mouche, on les équipe de petites séquences d’ADN provenant des éléments mobiles qui permettent cette intégration. Ces petites séquences d’ADN s’appellent des piedsPetites séquences (quelques dizaines de nucléotides) qui bornent un élément transposable et permettent son intégration dans le génome.. Ils permettront aux deux molécules d’ADN (la construction-rapporteur et le chromosome de mouche) de recombiner. L'objectif est bien d’insérer dans le chromosome de la mouche le fragment d’ADN contenu entre les pieds de la construction-rapporteur.

Organismesgénétiquement modifiés OGM

Signet
Position sauvegardée

Organismes génétiquement modifiés

Les animaux transgéniques (comme les mouches transgéniques que nous produisons au laboratoire) sont des organismes génétiquement modifiés, c'est-à-dire des organismes dont on a modifié le génome. Ces modifications de génome peuvent prendre plusieurs formes, comme la modification d'un texte, il peut s'agir de changer la séquence (changer ou éliminer une partie du texte), ou bien de rajouter un morceau de séquence, comme par exemple une construction-rapporteur.

Le terme d'organisme génétiquement modifié, ou OGM, est aujourd'hui fortement connoté négativement. Il faut pourtant bien garder à l'esprit la distinction entre la technique (c'est-à-dire l'approche qui permet de modifier le génome et de produire ces organismes génétiquement modifiés) et les applications qui peuvent en découler. Ces applications peuvent être plus ou moins pertinentes et plus ou moins bénéfiques, ou au contraire sujettes à caution. Indépendamment des applications, du point de vue de la recherche fondamentale, les techniques de transgénèse ont permis de faire des progrès gigantesques dans la compréhension du fonctionnement des organismes et en particulier dans la compréhension du fonctionnement des gènes et des interrupteurs des gènes.

Cibler la lignée germinale

Signet
Position sauvegardée

Cibler la lignée germinale

Nous injectons ces constructions dans des embryons de mouche pour les intégrer au génome. L'injection à des embryons de drosophiles, qui sont particulièrement petits, est plus compliquée que la même manipulation sur une mouche adulte.

Mais injecter à des mouches adultes un fragment d'ADN va éventuellement modifier quelques cellules de leur corps. On ne changerait pas le génome de façon héréditaire. On ne pourrait pas établir une lignée de mouches qui a définitivement intégré le fragment que l'on cherche.

Pour construire une lignée transgénique qui porte la modification, il faut viser une catégorie très particulière de cellules : cellules reproductricesAussi appelées gamètes, ce sont les cellules qui fusionnent pour donne une cellule œuf qui va se développer en organisme adulte.. Le moment dans le cycle d'une mouche où l'on dispose de l'accès le plus simple à ces cellules reproductrices, c'est le tout début de l'embryogenèse, le moment où l'œuf vient d'être pondu. On sait qu'à ce moment-là, elles se retrouvent dans la partie la plus postérieure de l'embryon. Or, c'est précisément à cet endroit-là que l'on va injecter notre solution pour que ces cellules reproductrices baignent dans la molécule que l'on essaye d'intégrer à leur génome.

Micro-injection

Signet
Position sauvegardée

Micro-injection et micro-goutelette

L'injection des embryons de drosophile se fait sous un microscope à l'aide d'aiguilles très fines et très particulières avec lesquelles on va piquer la partie postérieure des embryons pour y injecter la solution d'ADN. L'aiguille, remplie de la solution d'ADN à injecter, est maintenue par une tige métallique et est reliée par un petit tuyau à un injecteur. Ce compresseur génère, à la demande, une pression qui va pousser la solution d'ADN contenue dans l'aiguille et générer une micro-gouttelette à l'extrémité de l'aiguille. Lorsque l'aiguille est introduite dans l'embryon et qu'on applique une pression avec l'injecteur, une petite goutte de solution d'ADN est injectée dans l'embryon. La solution d'ADN est colorée (avec un colorant alimentaire vert inoffensif) pour aider à visualiser la procédure d'injection.

Des aiguillessur mesure

Signet
Position sauvegardée

Des aiguilles sur mesure

Les aiguilles utilisées pour injecter les embryons sont produites grâce à une machine particulière, une étireuse de capillaires. Ces fins tubes de verre sont chauffés et étirés pour produire deux aiguilles creuses. L'étireuse consiste essentiellement en un filament de métal à travers lequel on fait passer le capillaire et qui va être porté à très haute température. Des bras reliés à un système de poulies vont tirer de chaque côté du capillaire fondu pour finalement le séparer en deux aiguilles identiques.

Les paramètres de température, de force et de vitesse de l'étireuse sont programmables afin de pouvoir donner aux aiguilles la forme désirée, et surtout obtenir de manière reproductible la même forme pour toutes les aiguilles.

Micro-injectionmicro-goutelette

Signet
Position sauvegardée

Micro-injection

Micro-gouttelettes

La technique de micro-injection requiert de la précision et de la dextérité, puisqu'il s'agit d'injecter des embryons de drosophile qui sont assez fragiles et mesurent un peu moins d'un demi millimètre de long. Les aiguilles utilisées sont très fines et permettent d'injecter dans l'embryon de très petits volumes de solution d'ADN (de l'ordre du nanolitre, soit des milliardièmes de litre).

La difficulté de l'injection est d'arriver à percer la paroi de l'embryon sans le détruire. Une fois l'extrémité de l'aiguille introduite à l'intérieur de l'embryon, on applique une légère pression à l'aide du compresseur pour injecter un petit volume. Puis on ressort l'aiguille délicatement pour ne pas endommager l'embryon.

Pendant les séances de micro-injection il vaut mieux vaut être le plus détendu possible, ne pas avoir bu trop de café. On espère que nos collègues ne vont pas claquer les portes pendant toute la séance, car les vibrations, même légères, se répercutent jusqu'au bout de l'aiguille !

Identifierles mouches transgéniques

Signet
Position sauvegardée

Identifier les mouches transgéniques

Chaque embryon injecté ne donnera pas naissance à une mouche transgénique. Seule une petite fraction des embryons aura intégré la construction-rapporteur dans les cellules reproductrices et l'aura transmise à sa descendance. En effet, les évènements d'intégration des constructions-rapporteurs dans les chromosomes sont d'une part aléatoires mais sont également peu fréquents (seul un faible pourcentage des embryons injectés donnera naissance à des mouches transgéniques).

Comment, alors, distinguer parmi toutes les mouches descendantes des mouches injectées, celles qui sont porteuses d'une construction-rapporteur (et qui sont donc transgéniques) de celles qui ne le sont pas ? Pour cela, on profite d'une astuce génétique qui consiste à utiliser un gène qui modifie la couleur des yeux des mouches.

Les drosophiles ont naturellement les yeux de couleur rouge foncé, mais il existe des mutants dont les yeux sont totalement dépourvus de pigments rouges, si bien que ces mouches mutantes ont les yeux blancs. Par ailleurs, on connait le gène nécessaire à la production de pigments rouges (c'est ce gène qui est muté, et donc non fonctionnel, chez les mutants aux yeux blancs). La construction d'ADN que l'on injecte inclut la version fonctionnelle de ce gène nécessaire à la production de pigments rouges (en plus d'un interrupteur génétique, du gène codant pour la GFP, et des pieds des éléments mobiles).

Les embryons de mouches que l'on injecte pour obtenir des mouches transgéniques sont des mutants aux yeux blancs. La descendance de ces mouches aura donc naturellement les yeux blancs. Sauf pour les mouches qui ont intégré dans leur génome la construction-rapporteur, qui est porteuse entre autre du gène qui va restaurer la couleur rouge des yeux ! Aussi, nous chercherons dans la descendance des mouches injectées les rares individus aux yeux rouges. Ces individus aux yeux rouges, et seulement ceux là, sont les mouches transgéniques qui contiennent dans leur génome une construction-rapporteur. Cette construction rapporteur est maintenant présente dans le génome de toutes les cellules de l'organisme, y compris les cellules reproductrices, elle va donc se maintenir au fil des générations de la lignée qu'on va établir à partir des mouches aux yeux rouges.

Une collectionde lignées transgéniques

Signet
Position sauvegardée

Une collection de lignées transgéniques

On vient de voir au cours de ce chapitre comment produire des lignées de mouches transgéniques contenant chacune une construction-rapporteur distincte. Chaque construction-rapporteur possède un petit bout d’ADN non-codant du gène yellow couplé au gène de la GFP, notre fameuse ampoule moléculaire. Elle devra potentiellement révèler l’activité d’interrupteur génétique des fragments d’ADN associés.

Nous disposons donc à présent d’une série de lignées transgéniques que nous allons pouvoir analyser. C’est à dire que nous allons observer la distribution de la GFP directement dans les mouches pour chaque lignée. C’est ce que nous verrons au prochain chapitre.